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法氏囊五肽（Bursopentin ，BP5）作用机制
免疫系统的基本功能是保护机体免于疾病的侵害。这些疾病不仅包括由于细菌、病毒及其他病原体引起的疾病，同时也包括癌症以及由于免疫失调自身免疫紊乱导致的疾病。免疫系统包括参与免疫应答的各种器官、组织细胞和免疫效应分子。胸腺和法氏囊是中枢免疫器官。胸腺不仅是T细胞分化、发育和成熟的场所，而且还可以分泌多种胸腺激素、调节机体的免疫功能，特别是细胞免疫功能。胸腺激素在疾病诊断和治疗中有重要的作用，现已广泛应用于治疗乙肝、丙肝、肿瘤、癌症和免疫缺陷等的研究中，是一类免疫增强剂或免疫调节剂。与胸腺具有相同地位的法氏囊是禽类的特有免疫器官，是B细胞发育分化和成熟的场所，法氏囊除具有中枢免疫器官的地位外，还作为外周免疫器官发挥作用。近年来通过对法氏囊免疫活性因子的研究发现，法氏囊中存在着对机体免疫功能具有重要调节作用的免疫活性因子。其中，囊素三肽是已知的法氏囊活性因子，但由于其功能的局限性限制了其应用。法氏囊五肽是由南京农业大学、南京大学、中国农业科学院、上海农业科学院的有关科研人员经过多年的潜心研究而发现的一种新的具有免疫调节功能和抗机体过氧化应激功能的活性肽，并已获得国家发明专利。法氏囊五肽（BP5）可以促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖、提高机体的体液免疫和细胞免疫的水平、还可以提高机体抗过氧化应激的能力，可以制成具有广泛应用前景的免疫调节、免疫治疗和抗过氧化作用的药物或制剂。
囊素五肽（BP5）的免疫调节活性
囊素五肽具有增强T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖的能力。囊素五肽不但具有提高机体体液免疫的功能而且还能提高机体的细胞免疫功能，并且具有平衡Th1和Th2类型免疫反应的功能。而囊素五肽的免疫平衡作用是一般免疫增强剂所不具备的。
1）囊素五肽具有提高血凝抗体滴度的能力
2）囊素五肽能够提高特异性抗体（IgG）的分泌水平且具有平衡抗体亚型（IgG1和IgG2a）分泌水平的能力
3）囊素五肽能够提高细胞因子的分泌水平
囊素五肽不但能提高代表Th1类型免疫反应的细胞因子IL-2 和IFN-γ的水平，同时能显著提高代表Th2类型的细胞因子IL-4 和 IL-10的水平。
4）囊素五肽能够显著提高脾脏T淋巴细胞CD3+CD4+和CD3+CD8+的百分率
5）囊素五肽能够提高特异性CTL对靶细胞的杀伤活性
囊素五肽的抗过氧化应激的活性
1）囊素五肽具有较强的还原能力，具有中和自由基的能力
2）囊素五肽具有抗脂质体过氧化的能力
3）囊素五肽能够有效地清除超氧阴离子
4）囊素五肽能够有效地清除羟基自由基
囊素五肽（BP5）的应用
①与疫苗配合应用时，能增强机体对疫苗的免疫应答反应，使保护性免疫水平提前出现，维持时间延长，抗体滴度明显提高。同时能有效地减轻免疫应激给机体带来的不利影响。
②能缓解或解除免疫抑制或免疫耐受状态，提高机体细胞免疫水平，消除免疫抑制和免疫耐受对疫苗免疫的不良影响。
③在对病毒性、细菌性疾病治疗时，单独或与抗毒杀菌药物配合使用，可激活机体自身免疫系统和淋巴细胞，诱导干扰素及白细胞介素等细胞因子的产生，增强药物对病毒、细菌等病原体的杀灭能力。
实施例2 囊素五肽（Bp5）的免疫调节活性
天然的囊素五肽具有增强有丝分裂原诱导的鼠脾脏T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖的能力。在此基础之上，发明人以4-6周龄小鼠为动物模型，以H9亚型禽流感病毒为抗原与不同浓度的囊素五肽混合免疫，分别于0、14、28天共免疫三次，分析了囊素五肽的免疫调节功能（见附表1）。通过下列实验可以发现囊素五肽不但能提高机体体液免疫的功能而且还能提高机体的细胞免疫功能，并且具有平衡Th1和Th2类型免疫反应的功能。
表1
Groups immunized antigen and Bp5 dosage
（10mice/group）
1 BPS 0.1ml
2 AIV 0.1ml
3 AIV + high doses of Bp5 0.1ml+500ug
4 AIV + middle doses of Bp5 0.1ml+100ug
5 AIV + low doses of Bp5 0.1ml+20ug
6 Commercial H9N2 Vaccine 107 TCID50
1) 囊素五肽（Bp5）具有提高血凝抗体滴度的能力（见附图3）
分别与免疫后7、21、35天分离血清，检测HA蛋白特异性血清效价。测定方法按照OIE标准进行。
2) 囊素五肽（Bp5）能够提高特异性抗体（IgG）的分泌水平且具有平衡抗体亚型（IgG1和IgG2a）分泌水平的能力（见附图4A、4B、4C）
分别于免疫后7、21、35 d分离血清检测H9N2 HA抗体，用0.05 M carbonate buffer pH 9.6（CBS）稀释大肠杆菌表达的重组H9N2 HA蛋白至10 µg/mL ，加入96孔酶标板中，每孔100 µL，4 ℃过夜包被，后用PBST洗涤3次。用1% BSA（m/v）于室温下封闭3 h，PBST洗涤3次。加入1:10–1:105（v/v）稀释的小鼠血清（每孔100 μL）作用1 h，再次以PBST洗涤3次。加入1:1 000 （v/v）稀释的过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG和1:2 000 （v/v）稀释的过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG1、IgG2a （每孔100 μL）作用1 h，PBST洗涤3次，拍干，加入现配的TMB显色液（每孔100 μL），室温避光反应20 min后，以2 M H2SO4 终止反应。在酶标仪上读取OD450。
每个血清稀释度对应一个ELISA OD值，绘制血清稀释度（log scale）对应OD值曲线。通过拟合曲线回归分析half maximal OD时的血清稀释度。 计算该血清稀释度的logarithm值来作为实验结果。每个血清滴定被重复三次。
3) 囊素五肽（Bp5）能够提高细胞因子的分泌水平
Treatment
IL-2（pg/mL）
IFN-γ（pg/mL）
IL-4（pg/mL）
IL-10（pg/mL）
PBS
prime
44.22±8.53
77.22±11.23
58.35±9.56
32.65±7.89
AIV
prime
58.18±10.78
75.45±9.67
77.09±12.31
45.89±6.92
AIV+500ugBP5
prime
67.34±13.95
95.65±17.81*
90.57±9.99
43.94±11.66
AIV+100ugBP5
prime
66.26±12.3
100.56±12.33﹡
95.87±23.11*
52.79±13.63
AIV+20ugBP5
prime
77.27±13.23*
103.12±25.11﹡﹡
100.35±11.23﹡
68.56±9.88b﹡
H9N2 Vaccine
prime
69.98±23.56
96.31±23.09*
87.66±9.67
50.37±8.91
PBS
1st boost
47.58±7.95
75.89±13.99
56.57±21.09
31.07±5.89
AIV
1st boost
69.13±15.11
82.06±16.88
88.93±31.09
46.19±14.74
AIV+500ugBP5
1st boost
76.33±10.79
100.67±22.66*
99.98±24.77
48.71±8.53
AIV+100ugBP5
1st boost
79.23±22.11
107.46±23.77*
120.78±17.92﹡﹡
55.22±8.76
AIV+20ugBP5
1st boost
90.42±18.99﹡
110.23±26.34﹡﹡
123.88±19.99﹡﹡
85.36±12.58﹡﹡
H9N2 Vaccine
1st boost
88.25±21.06*
101.73±19.04*
92.22±14.66
52.93±7.88
PBS
2nd boost
39.87±13.55
79.48±9.97
53.87±11.78
31.67±9.67
AIV
2nd boost
73.33±14.99
92.03±21.06
94.33±19.99
45.88±5.88
AIV+500ugBP5
2nd boost
88.57±15.87
106.38±19.88
105.39±24.81
50.73±10.23
AIV+100ugBP5
2nd boost
91.93±21.67*
118.44±25.53*
125.89±19.47﹡﹡
65.91±10.79﹡
AIV+20ugBP5
2nd boost
103.38±19.91﹡﹡
133.79±26.77﹡﹡
130.22±21.11﹡﹡
93.58±18.91﹡﹡
H9N2 Vaccine
2nd boost
99.44±19.77﹡
110.08±19.35*
110.27±22.11
45.41±11.26
Standard group is AIV. ﹡﹡Significant as p＜0.01， ﹡Significant as p＜0.05
囊素五肽不但能提高代表Th1类型免疫反应的细胞因子IL-2 和IFN-γ的水平，同时能显著提高代表Th2类型的细胞因子IL-4 和 IL-10的水平。
具体的检测方法是：分别于免疫后7、21、35 d分离血清检测免疫后小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ的含量，应用商品化的小鼠细胞因子试剂盒检测。按试剂盒说明书进行操作。每次分析时，使用对照的重组细胞因子标准品绘制标准曲线，通过标准曲线来计算血清样品中细胞因子的含量。
4）囊素五肽（Bp5）能够显著提高脾脏T淋巴细胞CD3+CD4+和CD3+CD8+的百分率
______________________________________________________________________________ Splenic lymphocyte (2 ×106)
Treat ment __________________________________________
CD3+CD4+CD8－ CD3+CD48+CD4－
BPS 23.15 ± 2.14 15.37 ± 1.89
AIV 37.09 ± 1.22 16.90 ± 2.13
AIV + high doses of Bp5 40.49 ± 2.16 21.43 ± 1.38*
AIV + middle doses of Bp5 43.80 ± 2.37* 24.22 ± 1.56*
AIV + low doses of Bp5 50.35 ± 1.75** 25.03 ± 2.12**
Commercial H9N2 Vaccine 37.59 ± 2.23 19.63 ± 1.86
Standard group is AIV. ﹡﹡Significant as p<0.01， ﹡Significant as p<0.05
具体的检测方法是： 最后一次免疫后7天分离小鼠脾淋巴细胞，通过流式细胞仪分析小鼠免疫后脾淋巴细胞中T细胞亚群和NK-T细胞的变化。制备的小鼠脾淋巴细胞 （2 ×106cells/mL） 用 100 µl PBS液重悬，加入5 µl FITC标记的anti-CD3 mAb，接下来加入5 µl PE anti-CD4 mAb或anti-CD8 mAb ,于4ºC孵育 30 min ，1200 rpm，离心10 min，PBS洗涤2次后用100 µL封闭液（PBS/1% BSA/0.1% NaN3）( m/v)重悬，4 ºC 保存待检测。通过FACScan 流式细胞仪检测不同表面抗原分子的荧光信号（BD , LSR），应用Cell Quest 软件分析实验数据。获取双参数散点图。
5）囊素五肽能够提高特异性CTL对靶细胞的杀伤活性（见附图5）
效应细胞制备
第三次免疫后1周后处死各组小鼠，在超净台内无菌操作取出脾脏，制备成单个脾细胞悬液，取淋巴细胞分离液入离心管管底，沿管壁小心加入两倍体积的脾细胞悬液，1200 rpm，离心20 min，沿管壁小心吸出界面层细胞，PBS洗涤3次，RPMI 1640营养液重悬细胞，计数细胞，使达到1×107cells/ 5 mL。参照同样的方法分离未免疫的同品系小鼠脾淋巴细胞，用100 µL无血清的RPMI 1640营养液重悬细胞，使浓度达到5×106cells/100 µL。细胞用H9 亚型禽流感病毒株A /Duck/ Jiangsu/NJ08/05（107PFU）37 ºC感染 2 h，用RPMI 1640营养液洗涤3次，用5ml RPMI 1640营养液重悬细胞，37 ºC , 5% CO2培养3 h后，3000 rad照射。接下来将5 mL 的免疫的小鼠脾淋巴细胞和禽流感病毒感染未免疫的同品系小鼠脾淋巴细胞37 ℃ 5% CO2 培养箱共孵育6 d，然后收集细胞， 2000 rpm离心10 min。细胞沉淀用含5% FBS（m/v）的RPMI 1640 悬浮， 调整细胞浓度至1×107 cells / mL，即为效应细胞。
靶细胞的制备
将NIH3T3细胞培养成致密单层，用JS株H9亚型禽流感病毒（108 PFU）37 ºC感染 2 h，然后收集细胞， 2 000 rpm 离心10 min。细胞沉淀用含5% FBS（m/v）的RPMI 1640 悬浮， 调整细胞浓度至1×106 cells / mL，即为靶细胞。
CTL 的检测
按Cytotoxicity Assay 试剂盒说明书确定靶细胞的最佳浓度。效应细胞与靶细胞数按效靶比100:1 、50:1 两个比例均匀混合于100 μL含5%FBS（m/v）的RPMI 1640培养基中，作为试验组。同时设立以下对照:效应细胞自发释放组、靶细胞自发释放组、靶细胞最大释放组、培养液对照以及体积校正对照组，各组均设4 个重复孔，每孔总体积100 μL 。4 h 后，于570 nm波长下测定OD值。按照下列公式计算特异性细胞毒性T 细胞的百分率: CTL （%） = （ 试验孔OD值－效应细胞自发释放OD值－靶细胞自发释放OD值） / （靶细胞最大释放OD值－靶细胞自发释放OD值）。
法氏囊五肽的简易鉴别检测方法
方法 一 ：
根据法氏囊五肽活性基团与检测试剂A (无色透明溶液)反应生成黄色物质进行检测。
将2-3毫升纯净水加入法氏囊五肽冻干品后，溶液呈透明无色。取此一定体积的法氏囊五肽溶液（0.1毫升）稀释10倍（1毫升）后加入一滴检测试剂A，摇匀，法氏囊五肽溶液应呈透明黄色。
方法 二 ：
法氏囊五肽具有清除体内外超氧自由基和羟基自由基的能力。利用法氏囊五肽的这一性能进行检测。
将2-3毫升纯净水加入法氏囊五肽冻干品后，溶液呈透明无色。取此一定体积的法氏囊五肽溶液缓慢滴加到0.1-0.5毫升检测试剂B(玫瑰红色)溶液中, 检测试剂B溶液的玫瑰红色逐渐变浅直至变为无色透明的液体。
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